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外泌体与间充质干细胞!

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人体中几乎所有类型的细胞都能产生外泌体,它广泛存在于组织细胞间隙及体液中。以往大家都错误地认为外泌体属于细胞“垃圾”,且因此低估它的重要作用。虽然外泌体在30多年前被发现,但是直到最近这些年才开始意识到其重要性。

 

什么是外泌体?

 

外泌体(Exosome)是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构,内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳,外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞,都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来,在血液等体液内传播,最后又可被其他细胞吞噬,是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。免疫细胞和肿瘤细胞之间通过外泌体进行信息交换,这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用。外泌体既可以通过抑制免疫细胞(DCs、NK细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞等)引发的抗肿瘤反应,以及诱导免疫抑制或调节细胞群(MDSCs、Tregs和Bregs)的免疫抑制。

 

外泌体的发展历史

 

1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现,1987年Johnstone将其命名为“Exosome”。随后的10年,外泌体并未受到足够的重视。

直至1996年,G.Raposo发现类似于B淋巴细胞能分泌抗原提呈外泌体,这种外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明这种B细胞来源的外泌体可以直接刺激效应CD4+细胞的抗肿瘤反应。

1998年,L.Zitvogel等发现树突细胞(DC cell)也能产生有抗原提呈能力的外泌体,而且外泌体含有功能性的MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子,还有共刺激因子。这种外泌体启动了特异性的CTL杀伤作用,促进了T细胞依赖的抗肿瘤效应。

H.Valadi等发现,细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。这意味着细胞可以通过外泌体影响另外一个细胞,甚至可以把自己的基因强加给另外一个细胞。研究人员逐渐对小小的外泌体产生了极大的好奇。他们发现,肿瘤细胞的外泌体与正常细胞的外泌体之间存在差异,肿瘤的外泌体会促进肿瘤的生长和转移,肿瘤周围组织细胞分泌的外泌体具备杀伤肿瘤细胞的能力等等。2013年的诺贝尔生理或医学奖颁给了三位科学家,他们分别是美国科学家James E. Rothman和Randy W. Schekman,德国科学家Thomas C. Südhof,以表彰他们发现细胞内部囊泡(外泌体等)运输调控机制。使外泌体的研究达到全新的高度。就外泌体的研究方向而言,干细胞、免疫、microRNA、靶向给药、癌症的诊断及治疗等都是热门研究领域。

2015年JHuan等人证实了急性髓细胞白血病(AML)的外泌体在白血病的骨髓微环境中具有抑制造血干细胞的功能。同年WANGY等人发现诱导多能干(iPS)细胞的外泌体可以在心肌细胞受到急性心肌缺血(MIR)影响时,给心肌细胞传送保护信号。

目前有关外泌体的研究,主要集中在外泌体颗粒的提取、纯化和内容物分析上。其中,外泌体的粒径表征和浓度信息是极为重要的参数。

 

外泌体的构成

 

外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年, Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌 的 exosome可以被人的肥大细胞捕获,并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质,不仅仅是mRNA,exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性,在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增,截止目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。

一类外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白,是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合,有文献报道称RAB4, RAB5和 RAB11主要出现在早期以及回收的核内体中,RAB7 和 RAB9主要出现在晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白,外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白(包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63, CD81 和CD9))、热休克蛋白家族((HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90以及一些细胞特异性的蛋白包括A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶(GAPDH, 烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白, P4HB, LDH, 亲环素 A,FASN, MDH1 和CNP)、核糖体蛋白(RPS3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子, ARF1, CDC42, 人类红细胞膜整合蛋白, SLC9A3R1)、粘附因子(MFGE8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素等。

 

外泌体的分离

 

目前,外泌体的分离多采用超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤三种方法。

超速离心:耗时耗力,往往需要8-30个小时;每次最多只能处理6个样品;需要大量的起始材料;产量不高。需一台超速离心机。

将欲提取的细胞培养上清液10ml,在4 ℃的环境下,300×g 10min,2000×g 20min,弃沉淀,去除细胞;然后 l0,000×g 30min ,弃沉淀,去除亚细胞成分;再用10,000×g 60min,弃掉上清液,最后所得沉淀既为exosome ,用30ml PBS 溶液重新悬浮沉淀物,混匀后再以10,000×g 60min,用 l ml PBS溶液悬浮沉淀物提纯的exosome 溶液分别装入eppendorf 管内,置于-80℃冰箱内保存备用。

磁珠免疫捕获:利用外泌体表面特有的表面标记物(如CD63、CD9蛋白),用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合,即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点,但是效率低,外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响,不利于下游实验,难以广泛普及。

超速离心法既耗时又费力。现在您可以通过使用灵活可控的总外泌小体分离试剂,从不同的起始样本中方便地富集完整的外泌小体。这些试剂及其配套的试验方案完美适用于广泛的实验计划,包括小输入样本量和多种样本处理实验。从培养细胞中富集的总外泌小体(使用总外泌小体分离试剂或超速离心)可以通过免疫磁性捕获法进一步纯化为亚组分。可使用基于Dynabeads?的CD63特异性试剂,或将链霉亲和素试剂与特定的生物素化抗体结合使用,可基于表面抗原的免疫反应纯化得到任何所需的亚组分。

 

外泌体的分析

 

如今外泌体分析用于临床诊断和治疗监控显然是一个重要领域。特定的跨膜蛋白信号可以识别肿瘤特异性的外泌体,而外泌体内蛋白的改变可以用于推断肿瘤细胞对治疗措施的反应。虽然外泌体有如此大的临床价值,但是临床日常外泌体分析却十分困难,这是因为目前缺少足够灵敏且快速的试验平台,尤其是进行外泌体蛋白质分析。

目前人们利用电镜来分析外泌体的大小和形态,利用流式细胞仪来分析细胞表面标记,通过Western blot和ELISA等方法对蛋白进行分析,或通过qPCR和新一代测序NGS来分析RNA。

流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量,而且通过荧光标记可以检测囊泡的来源,将囊泡进行分类,因此,流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。但是,传统流式细胞仪无法测量<300nm的外泌体,因此很难进行精确地定量和定性分析。

纳米颗粒跟踪分析技术(Nanosight Tracking Analysis,NTA)是一种比较新颖的表征纳米颗粒的方法,它可直接并实时观测纳米颗粒。NTA 通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号,拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像,对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。

通过SDS-PAGE电泳分析得到Exosome中蛋白的含量及种类;通过Western-Blot检测Exosome中特定的蛋白表达情况。

外泌体与人间充质干细胞(MSCs)

 

MSCs是干细胞家族的重要成员,属于多能干细胞,因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。人间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,还能向受损组织趋化。MSCs通过旁分泌方式释放细胞因子,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复,是一种有前景的能够用于疾病治疗的干细胞来源。

最近外泌体在MSCs中的作用机制正被广泛关注和研究,其内容物可以通过参与细胞间的信息传递和信号传导,以及在体内改变细胞或组织代谢,影响机体的损伤修复,并参与肿瘤、感染等疾病的诊断及治疗。MSCs的外泌体包含细胞因子、生长因子、信号脂质、各种mRNA和调节 miRNA等内容物。由于其纳米大小的尺寸和脂质外层特性,将其注入后,很容易通过血液循环到达损伤部位。目前MSCs来源的外泌体已用于器官损伤动物模型、肿瘤抑制及免疫应答调控模型等多项研究。

MSCs来源的外泌体应用

 

已有研究显示人类胚胎干细胞来源的MSC也可释放外泌体发挥心肌保护的作用。有研究在小鼠心肌缺血-再灌注损伤模型中发现,心肌内递送MSCs外泌体,可使心肌梗死面积减少,有效提高心肌细胞存活率。

蔡东升博士及其研究团队证明,下丘脑干细胞分泌的外泌体可以延缓衰老。该研究发现,随着下丘脑干细胞的消失,小鼠开始出现衰老症状。但随着植入经过改造的健康的下丘脑干细胞后,小鼠的衰老症状延迟并且寿命延长,进一步研究发现,该过程一部分是下丘脑干细胞通过释放外泌体来实现的。

另外,MSC来源的外泌体还可以有效地促进骨折的愈合、保护修复肾损伤,心肌衰弱、及后肢局部缺血的治疗,以及调节促进肌肉的再生等。动物实验中,应用MSC外泌体对于卵巢细胞衰老的治疗中,起到了显著的效果。更有体外细胞实验验证,人脐带间充质干细胞分泌的外泌体能够有效抑制顺铂诱导的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡,提高细胞的生存率。

与传统的干细胞疗法不同,外泌体不是活细胞,因此在被注射到身体的受损伤部位后,不会发展成为癌细胞。因此,外泌体可能作为替代干细胞治疗的新策略正在迅速获得重视,并且能够克服细胞治疗中的诸多风险和困难。

 

来源(CellMax胎牛血清

 

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点击次数:  更新时间:2019-07-30 15:15:44  【打印此页】  【关闭
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